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中科院天津所张学礼团队一年三叩Metabolic Engineering

发布时间:2018-01-05被浏览次数:


      导语:代谢工程是目前合成生物学主要方向之一,研究的主要思路是对工业微生物进行系统分析和整体改造,以达到高产产物的目的。Metabolic Engineering是该领域的Top级杂志。中科院天津所张学礼团队在代谢工程领域也是一支优秀的团队。


1. 在染色体多基因同时编辑技术

      理性设计了CRISPR/Cas9辅助的染色体多基因同时编辑技术(见下图)。该系统由三个质粒组成:质粒IpRBSL-genes)含有待调控的多个基因的调控文库元件及其同源臂;质粒IIpRedCas9)含有Cas9基因及重组酶Red;质粒IIIpgRNA-genes)提供多基因的引导gRNA,引导Cas9在正确的基因上切割。使用这三个质粒,通过两次转化和两次诱导,能在染色体上快速实现多个基因的同时文库调控,操作周期为4天。使用这一策略,对木糖代谢途径中四个基因(xylAB, tktAtalB)的表达同时进行了调控,基因同时编辑的效率达到70%;快速获得了木糖代谢速率提高的多基因编辑菌株,木糖代谢速率提高了3倍。该研究对代谢工程和合成生物学中的途径优化有很大的促进作用。(PMID28800965


CRISPR/Cas9多基因编辑系统

a)基于M1-93人工启动子设计RBS库,下划线显示RBS区域。红色表示用于构建供体DNA质粒对引物接头(b)供体DNA质粒RBS库构建。使用pHomo-genesDNA为模板扩增出三个含有RBS库的基因片段,用Golden-gate技术组装。(c)代谢途径目标基因的调控过程。共转化Cas9质粒和供体DNA质粒,在阿拉伯糖的诱导下,供体DNA发生同源重组;再转化gRNA质粒,诱导Cas9切割非同源重组菌株,实现代谢途径多基因调控。(d)代谢途径多基因编辑步骤。

2. 在膜改造提高萜类化合物合成方面

      萜类化合物是天然产物的典型代表,有广泛的医疗保健作用和巨大的经济价值。构建微生物细胞工厂合成高附加值萜类化合物是代谢工程的研究热点。目前在提高微生物细胞工厂合成萜类化合物方面的改造策略主要集中在对关键蛋白进行改造以及对代谢途径进行精确调控,然而从细胞性能方面对细胞工厂进行改造的报道较少。萜类化合物通常是疏水化合物,它在细胞中的积累机制也没有深入的研究和明确的结论。研究了大肠杆菌细胞膜改造对提高萜类化合物合成能力的影响。研究结果显示,通过引入单葡萄糖甘油二酯合成酶Almgs将β-胡萝卜素的单位细胞含量提高了70%,并进一步增强了细胞膜主要成分甘油磷脂的合成途径,将β-胡萝卜素的单位细胞含量提高了2.9倍(由6.7 mg/g细胞干重提高至19.6 mg/g细胞干重)(见下图)。同时,在膜工程改造的大肠杆菌细胞的电镜图像中观察到向内的膜堆积,表明膜形态变化与β-胡萝卜素储存容量相关。膜分离和分析实验证实,增加的β-胡萝卜素主要集中在细胞膜部分。膜工程策略也适用于β-胡萝卜素高产菌株,使其产量提高了39%(由31.8 mg/g细胞干重提高至44.2 mg/g细胞干重),是目前报道的相同培养条件下的最高产量之一。本研究阐明了疏水萜类化合物在细胞内的积累机制,并为创建高产疏水化合物的细胞工厂提供了全新的改造思路。(PMID: 28688931


膜改造提高萜类化合物积累与合成

3. 在萜类化合物合成方面

      类胡萝卜素是一类代表性的萜类化合物,包括番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素等。中科院天津工业生物技术研究所张学礼研究员带领的微生物代谢工程研究团队前期在改造大肠杆菌生产类胡萝卜素方面有较好的研究基础,一方面通过对中央代谢途径的系统改造提高ATPNADPH供给,解决萜类化合物合成途径中辅因子不足的问题(Metab Eng, 2013);另一方面,通过细胞膜形态和细胞膜合成的改造提高大肠杆菌的细胞膜含量,解决萜类化合物在底盘细胞中的存储问题(Metab Eng, 2017)。萜类化合物的通用前体合成途径有两条,一条是MEP途径,另一条是MVA途径,这两条途径都能提供萜类化合物最关键的前体代谢物异戊烯焦磷酸(IPP)。大肠杆菌自身含有MEP途径,早期的研究发现dxsidi两个基因是MEP途径中的关键限速因子,然而目前对其它相关基因的研究较少,MEP途径中是否存在其它的限速因子还不清楚。本研究系统研究了MEP途径中其它5个基因(dxr, ispD, ispE, ispGispH)的表达量和β-胡萝卜素产量之间的相互关系。通过构建启动子文库分别调控这5个基因,研究细胞生长、β-胡萝卜素产量及代表性菌株相应基因的转录水平,发现ispG基因表达量与细胞生长以及β-胡萝卜素产量呈反比关系(见图)。MEP途径中间代谢物浓度测定发现IspG活性过高会导致其催化产物HMBPP积累;过表达ispG下游的ispH基因可以避免HMBPP积累,解除生长抑制,并将β-胡萝卜素产量提高73%。转录组分析发现HMBPP积累会导致核酸和蛋白合成相关的基因显著下调,表明HMBPP是有毒的中间代谢物。该研究表明ispGispHMEP途径中另一个重要的限速步骤,它们需要协同表达才能发挥作用。本研究进一步明确了MEP途径的调控机制,对构建高产萜类化合物的细胞工厂具有普适意义。(PMID: 28864262


中间代谢物HMBPP浓度和细胞生长以及β-胡萝卜素产量呈反比关系


来源:中科院天津所、中国合成生物学

0551-65689745